Come si esegue l’antibiogramma?

L’antibiogramma è uno dei test di laboratorio più importanti per guidare l’uso corretto degli antibiotici. Permette di capire se un batterio è sensibile, intermedio o resistente a uno o più farmaci, misurando in modo standardizzato la sua crescita in presenza di diverse molecole. È un esame centrale in microbiologia clinica, perché collega il risultato colturale (quale batterio è stato isolato) a indicazioni pratiche sulla scelta della terapia.

Conoscere come si esegue un antibiogramma aiuta medici, infermieri e pazienti a interpretare meglio i referti e a comprendere perché, in alcune situazioni, il clinico decide di modificare un antibiotico già iniziato. Questa guida descrive in modo sistematico le fasi principali: dalla preparazione del campione ai metodi più usati, fino all’interpretazione dei risultati, alle limitazioni del test e alle sue applicazioni nella pratica clinica e nelle strategie di stewardship antibiotica.

Preparazione del campione

La qualità dell’antibiogramma dipende in modo cruciale dalla corretta preparazione del campione. Tutto inizia dalla raccolta del materiale biologico: sangue, urine, espettorato, liquido cerebrospinale, tamponi da ferita o da altri distretti. Ogni tipo di campione richiede contenitori sterili adeguati, tempi di trasporto brevi e, quando necessario, terreni di trasporto che mantengano vitali i microrganismi senza farli moltiplicare in modo incontrollato. Una raccolta non corretta (per esempio urine contaminate dalla flora perineale o un tampone mal eseguito) può portare a risultati fuorvianti, con crescita di batteri non realmente responsabili dell’infezione.

Una volta in laboratorio, il campione viene seminato su terreni di coltura idonei, spesso agar sangue o agar cioccolato per batteri esigenti, oppure terreni selettivi per particolari specie. Dopo l’incubazione, il microbiologo seleziona le colonie sospette, cioè quelle che per morfologia, colore, emolisi o altre caratteristiche suggeriscono il possibile patogeno. Da queste colonie si prepara una sospensione batterica standardizzata, regolando la torbidità a un valore di riferimento (ad esempio un determinato standard di densità cellulare) per garantire che tutti gli antibiogrammi siano eseguiti con una concentrazione batterica comparabile. Questo passaggio è essenziale per rendere confrontabili i risultati tra pazienti e nel tempo, e per applicare correttamente i criteri interpretativi.

La sospensione batterica viene poi utilizzata per inoculare una nuova piastra di agar, in genere un agar specifico per test di sensibilità. L’inoculo viene distribuito in modo uniforme sulla superficie del terreno, con una tecnica detta “semina a tappeto”, che mira a ottenere un film batterico omogeneo dopo l’incubazione. Un’inoculazione troppo densa o troppo scarsa può alterare il diametro delle zone di inibizione attorno ai dischi antibiotici, portando a una classificazione errata di sensibilità o resistenza. Per questo motivo, i laboratori seguono protocolli standardizzati e controlli di qualità interni, utilizzando ceppi di riferimento con profili di sensibilità noti.

Prima di posizionare gli antibiotici, il microbiologo verifica che la piastra sia asciutta ma non disidratata, e che la sospensione batterica sia stata preparata da colonie giovani, in fase di crescita attiva. Vengono scelti gli antibiotici da testare in base al tipo di batterio isolato, al sito di infezione e alle linee guida locali. Per esempio, per un batterio respiratorio si selezionano molecole diverse rispetto a un patogeno urinario. In questa fase è importante considerare anche eventuali resistenze note nella popolazione batterica locale e le caratteristiche farmacologiche dei farmaci, come la capacità di raggiungere concentrazioni efficaci nel distretto infetto.

Metodi di antibiogramma

Il metodo più diffuso per eseguire l’antibiogramma è il test di diffusione su disco, spesso indicato come metodo Kirby-Bauer. Su una piastra di agar precedentemente inoculata con la sospensione batterica standardizzata, si applicano piccoli dischi di carta impregnati con quantità note di diversi antibiotici. Durante l’incubazione, l’antibiotico diffonde radialmente nel terreno, creando un gradiente di concentrazione. Se il batterio è sensibile, attorno al disco si forma una zona di inibizione, cioè un’area circolare priva di crescita batterica. Dopo un tempo di incubazione standard, in genere compreso tra 18 e 24 ore, il diametro di queste zone viene misurato in millimetri con un righello o con sistemi digitali.

Oltre al metodo su disco, esistono tecniche quantitative che determinano la concentrazione minima inibente (MIC), cioè la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire visibilmente la crescita del batterio. La MIC può essere misurata con metodi di diluizione in brodo o in agar, oppure con strisce gradiente (come le E-test), che combinano il principio della diffusione con una scala di concentrazioni stampata sulla striscia. Questi metodi sono particolarmente utili quando è necessario un dato quantitativo preciso, ad esempio per infezioni gravi, per farmaci con finestra terapeutica stretta o per batteri con meccanismi di resistenza complessi.

Negli ultimi anni si sono diffusi anche sistemi automatizzati di antibiogramma, che utilizzano pannelli di microdiluizione in brodo e lettori ottici per valutare la crescita batterica in presenza di diverse concentrazioni di antibiotici. Queste piattaforme permettono di processare un elevato numero di campioni in parallelo, riducendo i tempi di risposta e standardizzando la lettura. Alcuni software dedicati sono in grado di analizzare automaticamente le immagini delle piastre di diffusione su disco, misurando le zone di inibizione e confrontandole con i breakpoint di riferimento, con un buon accordo rispetto alla lettura manuale dell’esperto. Questi strumenti digitali contribuiscono a ridurre la variabilità inter-osservatore e a velocizzare il flusso di lavoro in laboratorio.

La scelta del metodo dipende da diversi fattori: tipo di batterio, risorse del laboratorio, urgenza clinica, necessità di dati quantitativi e linee guida internazionali (come quelle di EUCAST o CLSI). Per molti patogeni comuni, il test su disco è sufficiente e affidabile; per altri, come alcuni batteri a crescita lenta o con pattern di resistenza particolari, possono essere preferiti metodi di MIC o sistemi automatizzati. In ogni caso, è fondamentale che il laboratorio adotti procedure validate, partecipi a programmi di controllo di qualità esterni e aggiorni regolarmente i propri protocolli in base alle raccomandazioni più recenti.

Interpretazione dei risultati

Una volta misurate le zone di inibizione o determinate le MIC, il passo successivo è l’interpretazione dei risultati. I valori grezzi (diametri in millimetri o concentrazioni in mg/L) non sono di per sé sufficienti: devono essere confrontati con tabelle di breakpoint stabilite da organismi internazionali come EUCAST o CLSI. Questi breakpoint definiscono, per ogni combinazione batterio-antibiotico, le soglie che distinguono ceppi sensibili (S), intermedi (I) o resistenti (R). Per esempio, un diametro di inibizione superiore a una certa soglia può indicare sensibilità, mentre un diametro inferiore a un’altra soglia indica resistenza; valori intermedi rientrano nella categoria “I”.

Nel referto di laboratorio, il clinico trova di solito una tabella con l’elenco degli antibiotici testati e, accanto a ciascuno, la categoria S, I o R, talvolta accompagnata dal valore di MIC o dal diametro della zona. È importante ricordare che “sensibile” non significa automaticamente che l’antibiotico sia la scelta migliore per quel paziente: entrano in gioco anche fattori farmacocinetici (come l’assorbimento e la distribuzione nel corpo), farmacodinamici (rapporto concentrazione/efficacia), sede dell’infezione, allergie note e interazioni con altri farmaci. Allo stesso modo, un risultato “intermedio” può essere clinicamente utilizzabile in alcune situazioni, ad esempio se è possibile ottenere concentrazioni più elevate del farmaco nel sito di infezione.

L’interpretazione richiede anche di considerare il contesto clinico. Per un’infezione urinaria non complicata, un antibiotico classificato come sensibile e che raggiunge alte concentrazioni nelle urine può essere appropriato, mentre per una meningite batterica si privilegiano molecole che attraversano efficacemente la barriera emato-encefalica. Inoltre, alcuni meccanismi di resistenza (come la produzione di beta-lattamasi a spettro esteso o carbapenemasi) possono richiedere test aggiuntivi o interpretazioni particolari, perché influenzano la scelta terapeutica oltre la semplice categoria S/I/R. Per questo motivo, i laboratori spesso aggiungono note interpretative o suggerimenti, soprattutto in presenza di resistenze critiche.

Infine, i risultati dell’antibiogramma vengono utilizzati non solo a livello del singolo paziente, ma anche per costruire antibiogrammi cumulativi di reparto o di struttura, che riassumono la percentuale di sensibilità dei principali patogeni ai diversi antibiotici in un determinato periodo. Questi strumenti sono fondamentali per la definizione delle terapie empiriche (cioè iniziate prima di conoscere il risultato colturale) e per monitorare l’andamento delle resistenze nel tempo. Una corretta interpretazione, quindi, richiede competenze microbiologiche e cliniche integrate, e si inserisce in un più ampio approccio di stewardship antibiotica volto a preservare l’efficacia dei farmaci disponibili.

Limitazioni dell’antibiogramma

Nonostante la sua importanza, l’antibiogramma presenta diverse limitazioni che è essenziale conoscere per evitare interpretazioni fuorvianti. Innanzitutto, si tratta di un test in vitro, eseguito in condizioni controllate di laboratorio che non riproducono perfettamente l’ambiente dell’organismo umano. La concentrazione di antibiotico nel sangue o nei tessuti, il pH, la presenza di proteine leganti il farmaco e la risposta immunitaria del paziente possono modificare l’efficacia clinica rispetto a quanto osservato sulla piastra di agar. Un batterio classificato come sensibile potrebbe non rispondere alla terapia in un paziente con ridotta perfusione tissutale o con un focus infettivo poco raggiungibile dal farmaco.

Un’altra limitazione riguarda il tempo necessario per ottenere il risultato. Dalla raccolta del campione alla refertazione dell’antibiogramma possono trascorrere diversi giorni, soprattutto se il batterio cresce lentamente o se sono necessari test di identificazione aggiuntivi. In molte situazioni cliniche, come sepsi o meningiti, il medico deve iniziare una terapia empirica prima di conoscere il profilo di sensibilità, basandosi su linee guida e dati epidemiologici locali. L’antibiogramma permette poi di “de-escalare” o modificare la terapia, ma non sempre è disponibile in tempo per guidare la scelta iniziale.

Esistono inoltre limiti legati alla complessità delle infezioni. In alcune situazioni, come le infezioni polimicrobiche (coinvolgimento di più specie batteriche) o le biofilm-associated infections (infezioni associate a biofilm su protesi o dispositivi), l’antibiogramma tradizionale può non riflettere accuratamente la reale sensibilità in vivo. I batteri in biofilm, ad esempio, possono mostrare una tolleranza agli antibiotici molto maggiore rispetto alle cellule planktoniche testate in laboratorio. Inoltre, alcuni meccanismi di resistenza emergono solo in particolari condizioni o dopo esposizione prolungata al farmaco, e possono non essere rilevati da un singolo test standard.

Infine, l’antibiogramma è limitato dal pannello di antibiotici scelto dal laboratorio. Non tutti i farmaci disponibili vengono testati di routine, sia per motivi di costo sia per la necessità di seguire linee guida che privilegiano alcune molecole rispetto ad altre. Può accadere che un antibiotico potenzialmente utile non compaia nel referto semplicemente perché non è stato incluso nel pannello standard. In questi casi, il clinico può richiedere test aggiuntivi, ma ciò comporta ulteriori tempi e risorse. Tutte queste limitazioni sottolineano l’importanza di interpretare l’antibiogramma come uno strumento di supporto, da integrare con il quadro clinico complessivo e non come un responso assoluto.

Applicazioni cliniche

Le applicazioni cliniche dell’antibiogramma sono molteplici e toccano diversi livelli dell’assistenza sanitaria. A livello del singolo paziente, il test consente di passare da una terapia empirica, basata su probabilità e dati epidemiologici, a una terapia mirata, scelta sulla base del profilo di sensibilità del batterio isolato. Questo approccio migliora le probabilità di successo terapeutico, riduce il rischio di effetti indesiderati legati a farmaci inutilmente ampi e contribuisce a limitare la selezione di ceppi resistenti. In patologie come le infezioni del tratto urinario, le polmoniti nosocomiali, le batteriemie e le infezioni di ferita chirurgica, l’antibiogramma è spesso decisivo per ottimizzare la gestione.

Su scala più ampia, i risultati degli antibiogrammi vengono aggregati per costruire antibiogrammi di reparto o di struttura, che rappresentano la distribuzione delle sensibilità dei principali patogeni in un determinato contesto (ospedale, casa di cura, comunità). Questi profili locali sono strumenti chiave per la stewardship antibiotica, cioè per programmi organizzati che mirano a migliorare l’uso degli antibiotici. Sulla base di tali dati, i comitati terapeutici possono aggiornare periodicamente le linee guida interne per la terapia empirica, scegliere quali antibiotici privilegiare o limitare e monitorare l’emergere di resistenze critiche nel tempo.

L’antibiogramma ha un ruolo importante anche nella gestione delle infezioni ricorrenti o complicate. In pazienti con infezioni che non rispondono alla terapia iniziale, il test permette di verificare se il batterio ha sviluppato nuove resistenes o se, fin dall’inizio, era resistente al farmaco scelto. Questo è particolarmente rilevante in contesti come le infezioni associate a dispositivi medici, le osteomieliti, le endocarditi o le infezioni in pazienti immunocompromessi, dove la scelta dell’antibiotico deve essere particolarmente accurata e spesso prolungata nel tempo. In alcuni casi, l’antibiogramma può suggerire la necessità di combinazioni di antibiotici o di farmaci di “ultima linea”.

Infine, i dati di sensibilità raccolti attraverso gli antibiogrammi contribuiscono alla sorveglianza epidemiologica delle resistenze antimicrobiche a livello regionale, nazionale e internazionale. Le autorità sanitarie utilizzano queste informazioni per identificare trend emergenti, come l’aumento di ceppi produttori di carbapenemasi o di batteri multiresistenti, e per pianificare interventi di sanità pubblica, campagne di sensibilizzazione e aggiornamenti normativi. In questo modo, l’antibiogramma non è solo un test di laboratorio, ma un tassello fondamentale nella strategia globale per contrastare l’antibiotico-resistenza e preservare l’efficacia delle terapie disponibili per le generazioni future.

In sintesi, l’antibiogramma è un esame cardine della microbiologia clinica che, attraverso una preparazione accurata del campione, l’uso di metodi standardizzati e un’interpretazione attenta dei risultati, guida la scelta degli antibiotici più appropriati. Pur con le sue limitazioni, rappresenta uno strumento indispensabile sia per la cura del singolo paziente sia per la programmazione di strategie di stewardship e di sorveglianza delle resistenes. La sua corretta comprensione e integrazione nel percorso diagnostico-terapeutico sono essenziali per un uso responsabile e razionale degli antibiotici.

Per approfondire

NIH / NCBI – Rapid direct disk diffusion testing offre una descrizione dettagliata del metodo classico di diffusione su disco, dei tempi di incubazione standard e dell’interpretazione delle zone di inibizione in relazione ai breakpoint di sensibilità.

NIH / NCBI – AntibiogramJ: analisi automatizzata delle piastre illustra come i software di image analysis possano misurare automaticamente le zone di inibizione, migliorando standardizzazione e velocità nella lettura degli antibiogrammi.

WHO – Laboratory methods for the diagnosis of meningitis presenta protocolli di laboratorio completi, inclusa l’esecuzione dell’antibiogramma con metodo Kirby-Bauer, dalla preparazione dell’inoculo alla lettura dei risultati.

WHO – Annex con standard Kirby-Bauer fornisce tabelle di riferimento per i diametri delle zone di inibizione e i relativi breakpoint, utili per comprendere i criteri di classificazione S/I/R.

CDC – Core Elements of Antibiotic Stewardship spiega come utilizzare gli antibiogrammi di struttura, aggiornati periodicamente, per guidare la scelta empirica degli antibiotici e supportare programmi di stewardship.